Glikosida Steviol

GLIKOSIDA STEVIOL

PENDAHULUAN

Glikosida steviol merupakan kandungan kimia dari daun Stevia rebaudiana Bertoni dan berasa manis. Glikosida steviol memiliki ikatan aglikon steviol yang sama pada jenis dan jumlah unit glikosida berbeda (misalnya glukosa, rhamnosa, xilosa, fruktosa, atau deoksiglukosa). Sampai tahun 2021 sudah teridentifikasi lebih dari empat puluh jenis glikosida steviol seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>. Glikosida steviol dalam makanan berfungsi sebagai pemanis. Glikosida steviol 100 hingga 300 kali lebih manis dibandingkan sukrosa.

Glikosida mayor yang terdapat dalam ekstrak daun Stevia rebaudiana Bertoni adalah steviosida dan rebaudiosida A. Glikosida minor meliputi rebaudiosida M dan rebaudiosida D. Beberapa glikosida minor telah ditentukan memiliki karakteristik sensoris yang lebih baik dari pada glikosida mayor. Hal ini mendorong pengembangan teknologi baru untuk menghasilkan glikosida steviol dengan proporsi glikosida minor yang lebih tinggi untuk memodifikasi profil sensorik dalam perdagangan. Pendekatan berikut ini ditujukan untuk mengatur glikosida steviol yang diproduksi menggunakan empat metode berikut:

  1. Glikosida steviol yang diektraksi dari daun Stevia rebaudiana Bertoni.

  2. Glikosida steviol dari fermentasi: melalui proses dimana mikroorganisme yang dimodifikasi secara genetik digunakan untuk menghasilkan glikosida steviol spesifik.

  3. Glikosida steviol termodifikasi enzim: melalui proses dimana glikosida steviol yang telah diekstraksi dari daun Stevia rebaudiana Bertoni mengalami konversi enzimatik dari glikosida steviol mayor menjadi minor.

  4. Glikosida steviol dimodifikasi enzim yang terglukosilasi: melalui proses di mana glikosida steviol yang telah diekstraksi dari daun Stevia rebaudiana Bertoni direaksikan dengan katalis enzim untuk menambahkan unit glukosa ke glikosida steviol melalui hubungan α-(1-4).

Penetapan kadar keempat monografi glikosida steviol diatas tercantum pada Penetapan Kadar Glikosida Steviol <85>. Informasi kimia terkait CAS, Nama Kimia, Rumus Molekul, BM seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>.

GLIKOSIDA STEVIOL YANG BERASAL DARI STEVIA REBAUDIANA BERTONI

Steviol glycosides from Stevia rebaudiana Bertoni

INS 960a

CAS, Nama Kimia, Rumus Molekul, BM seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>

DEFINISI Glikosida steviol terdiri dari campuran senyawa yang mengandung steviol yang terkonjugasi ke sejumlah atau kombinasi dari bagian sakarida (glukosa, ramnosa, xilosa, fruktosa, arabinosa, galaktosa dan deoksiglukosa) di salah satu orientasi yang terjadi di daun Stevia rebaudiana Bertoni. Glikosida steviol diperoleh dari daun Stevia rebaudiana Bertoni. Daunnya diekstrak dengan air panas dan ekstrak air dilewatkan resin penjerap untuk menjerap dan memekatkan komponen glikosida steviol. Resin dibilas dengan etanol untuk melarutkan glikosida, kemudian direkristalisasi dengan metanol atau etanol air. Dapat digunakan resin penukar ion untuk proses pemurnian. Produk akhir dapat dikeringkan dengan spray-dried.

Glikosida steviol mengandung tidak kurang dari 95% dari total glikosida steviol dihitung terhadap zat kering, ditentukan sebagai jumlah campuran senyawa yang mengandung steviol yang terkonjugasi dengan beberapa sakarida (glukosa, ramnosa, fruktosa, deoksiglukosa xilosa, galaktosa, arabinosa, dan xilosa) yang terdapat dalam daun Stevia rebaudiana Bertoni.

PEMERIAN Serbuk, putih hingga kuning muda, tidak berbau atau bau khas lemah. Kemanisan 200–300 kali dibanding dengan sukrosa.

Perubahan

KELARUTAN Sangat sukar larut hingga mudah larut dalam air, sukar larut hingga mudah larut dalam campuran etanol dan air (50:50).

PENGGUNAAN Pemanis.

IDENTIFIKASI

  1. Kromatogram puncak mayor yang diperoleh dari Penetapan kadar sesuai dengan puncak Glikosida steviol.

  2. pH <909> Antara 4,5 dan 7 (1 dalam 100).

KEMURNIAN

  1. Abu total Tidak lebih dari 1%. Lakukan penetapan seperti tertera pada Abu <707>.

  2. Susut pengeringan <912> Tidak lebih dari 6%. Lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 2 jam.

  3. Sisa pelarut <716> Metode 1 Tidak lebih dari 200 bpj metanol dan tidak lebih dari 5000 bpj etanol.

  4. Arsen <708> Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik serapan atom hidrida yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  5. Timbal Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik spektroskopi serapan atom yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

Tambahan persyaratan

  1. Uji mikrobiologi <51> Angka lempeng total: tidak lebih dari 1.000 cfu per g; Kapang dan khamir: tidak lebih dari 200 cfu per g; Salmonella spp: negatif dalam 25 g; E.coli: negatif dalam 1 g.

Perubahan

PENETAPAN KADAR Lakukan penetapan seperti tertera Penetapan Kadar Glikosida Steviol <85>.

GLIKOSIDA STEVIOL HASIL FERMENTASI

Steviol glycosides from fermentation

INS -

CAS, Nama Kimia, Rumus Molekul, BM seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>

DEFINISI Glikosida steviol hasil fermentasi berisi campuran senyawa yang mengandung steviol yang terkonjugasi ke berbagai bagian sakarida (glukosa atau sukrosa) tergantung pada organisme dan kondisi fermentasi yang digunakan.

Glikosida steviol hasil fermentasi diperoleh dari fermentasi strain non-patogen non-toksigenik dari Yarrowia lipolytica dan Saccharomyces cerevisiae yang telah dimodifikasi secara genetik dengan gen heterolog dari banyak organisme donor untuk menghasilkan glikosida steviol secara berlebihan. Setelah penghilangan biomassa dengan pemisahan padat-cair dan perlakuan panas, proses tersebut melibatkan konsentrasi glikosida steviol (misalnya dengan adsorpsi resin), diikuti dengan pemurnian glikosida steviol yang diinginkan secara kristalisasi dan pengeringan. Dapat digunakan resin penukar ion untuk proses pemurnian. Produk akhir dapat dikeringkan dengan spray-dried. Produk dalam perdagangan terutama terdiri dari Rebaudioside A, Rebaudioside M, atau kombinasi Rebaudioside M dan Rebaudioside D, glikosida steviol minor lain mungkin ditemukan.

Glikosida steviol hasil fermentasi mengandung tidak kurang dari 95% dari total glikosida steviol dihitung terhadap zat kering.

PEMERIAN Serbuk, putih hingga kuning muda, tidak berbau atau bau khas lemah. Kemanisan 200–300 kali dibanding dengan sukrosa.

KELARUTAN Sangat sukar larut hingga mudah larut dalam air, sukar larut hingga mudah larut dalam campuran etanol dan air (50:50).

PENGGUNAAN Pemanis.

IDENTIFIKASI

  1. Kromatogram puncak mayor yang diperoleh dari Penetapan kadar sesuai dengan puncak Glikosida steviol.

  2. pH <909> Antara 4,5 dan 7 (1 dalam 100).

KEMURNIAN

  1. Abu total Tidak lebih dari 1%. Lakukan penetapan seperti tertera pada Abu <707>.

  2. Susut pengeringan <912> Tidak lebih dari 6%. Lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 2 jam.

  3. Sisa pelarut <716> Metode 1 Tidak lebih dari 200 bpj metanol dan tidak lebih dari 5000 bpj etanol.

  4. Arsen <708> Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik serapan atomik hidrida yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  5. Timbal Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik spektroskopi serapan atom yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  6. Uji mikrobiologi <51> Angka lempeng total: tidak lebih dari 1.000 cfu per g; Kapang dan khamir: tidak lebih dari 200 cfu per g; Salmonella spp: negatif dalam 25 g; E.coli: negatif dalam 1 g.

PENETAPAN KADAR Lakukan penetapan seperti tertera Penetapan Kadar Glikosida Steviol <85>.

GLIKOSIDA STEVIOL TERMODIFIKASI ENZIM

Enzym Modified Steviol Glycosides

INS -

CAS, Nama Kimia, Rumus Molekul, BM seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>

DEFINISI Glikosida steviol termodifikasi enzim terdiri dari campuran senyawa yang mengandung steviol yang terkonjugasi ke berbagai bagian sakarida (glukosa, rhamnosa, xilosa, fruktosa, arabinosa, galaktosa dan deoksiglukosa) yang terdapat dalam daun Stevia rebaudiana Bertoni. Produk ini diperoleh dari perlakuan enzimatik glikosida steviol murni yang diekstraksi dari daun Stevia rebaudiana Bertoni. Ekstrak yang telah dimurnikan diberi perlakuan dengan enzim yang diproduksi oleh strain non-patogen non-toksik dari Pichia pastoris dan Escherichia coli yang telah dimodifikasi secara genetik dengan gen dari beberapa organisme donor (tercantum di bawah) untuk menghasilkan glukosiltransferase (EC 2.4.1.17) dan sukrosa sintase (EC 2.4.1.13). Bahan yang dihasilkan dipanaskan dan disaring untuk menggumpalkan dan menghilangkan enzim yang berlebih. Kemudian pekatkan menggunakan resin adsorpsi/desorpsi atau penyaringan padat/cair, dilanjutkan dengan purifikasi dan pembuatan produk untuk perdagangan, menggunakan proses yang dapat mencakup dekolorisasi, kristalisasi, dan spraydrying.

Teknik pembuatan ini memaksimalkan produksi glikosida steviol spesifik yang secara alami tidak terdapat dalam kadar tinggi pada ekstrak daun, terutama rebaudiosida M dan rebaudiosida D dengan sejumlah kecil glikosida steviol lainnya.

Organisme penghasil enzim Sumber gen
Pichia pastoris

Horedum vulgare L

Stevia rebaudiana Bertoni

Vigna radiate
   
Escherichia coli

Acidithiobacillus caldus

Arapidopsis thaliana

Solanum tuberosum Stevia rebaudiana Bertoni

Glikosida steviol termodifikasi enzim mengandung tidak kurang dari 95% dari total glikosida steviol dihitung terhadap zat kering.

PEMERIAN Serbuk, putih hingga kuning muda, tidak berbau atau bau khas lemah. Kemanisan 200–300 kali dibanding dengan sukrosa.

KELARUTAN Sangat sukar larut hingga mudah larut dalam air, sukar larut hingga mudah larut dalam campuran etanol dan air (50:50).

PENGGUNAAN Pemanis.

IDENTIFIKASI

  1. Kromatogram puncak mayor yang diperoleh dari Penetapan kadar sesuai dengan puncak Glikosida steviol.

  2. pH <909> Antara 4,5 dan 7 (1 dalam 100).

KEMURNIAN

  1. Abu total Tidak lebih dari 1%. Lakukan penetapan seperti tertera pada Abu <707>.

  2. Susut pengeringan <912> Tidak lebih dari 6%. Lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 2 jam.

  3. Sisa pelarut <716> Metode 1 Tidak lebih dari 200 bpj metanol dan tidak lebih dari 5000 bpj etanol.

  4. Arsen <708> Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik serapan atom hidrida yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  5. Timbal Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik spektroskopi serapan atom yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  6. Uji mikrobiologi <51> Angka lempeng total: tidak lebih dari 1.000 cfu per g; Kapang dan khamir: tidak lebih dari 200 cfu per g; Salmonella spp: negatif dalam 25 g; E.coli: negatif dalam 1 g.

PENETAPAN KADAR Lakukan penetapan seperti tertera Penetapan Kadar Glikosida Steviol <85>.

GLIKOSIDA STEVIOL DIMODIFIKASI ENZIM YANG TERGLUKOSILASI

Enzyme modified glucosylated Steviol Glycosides

INS -

CAS, Nama Kimia, Rumus Molekul, BM seperti tertera pada Tabel Informasi Kimia Glikosida Steviol <851>

DEFINISI Glikosida steviol dimodifikasi enzim yang terglukosilasi adalah campuran glikosida steviol yang sebagian besar terdiri dari glikosida steviol terglukosilasi (misalnya, glikosida mono-, di-, dan tri-glikosida terglukosilasi) dengan sejumlah kecil glikosida steviol dari Stevia rebaudiana Bertoni. Diperoleh melalui penambahan enzimatik glukosa [subunit 1-20 tambahan melalui ikatan α(1-4) glukosil] ke glikosida steviol murni yang diperoleh dari daun Stevia rebaudiana Bertoni. Cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) dan α-amilase (EC 3.2.1.1) dari strain Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, dan Bacillus subtilis non-patogen non-toksik digunakan untuk mempermudah transfer glukosa ke glikosida steviol. Bahan yang dihasilkan dipanaskan dan ditambah karbon aktif untuk menghilangkan enzim. Hasil dipekatkan menggunakan resin adsorpsi/desorpsi, dilanjutkan dengan pemurnian dan pembuatan produk untuk perdagangan, menggunakan proses yang dapat mencakup dekolorisasi, kristalisasi, dan spraydrying.

Teknik pembuatan ini memaksimalkan produksi glikosida steviol dimodifikasi enzim yang diglukosilasi yang tidak terdapat secara alami dalam ekstrak daun.

Glikosida steviol dimodifikasi enzim yang diglukosilasi mengandung tidak kurang dari 95% dari total glikosida steviol dihitung terhadap zat kering, bebas dekstrin, ditentukan sebagai jumlah glikosida steviol terglukosilasi dan glikosida steviol.

PEMERIAN Serbuk, putih hingga kuning muda, tidak berbau atau bau khas lemah. Kemanisan 100–167 kali dibanding dengan sukrosa.

KELARUTAN Mudah larut dalam air.

PENGGUNAAN Pemanis.

IDENTIFIKASI

  1. Kromatogram puncak mayor yang diperoleh dari Penetapan kadar sesuai dengan puncak Glikosida steviol.

  2. pH <909> Antara 4,5 dan 7,0 (1 dalam 100).

KEMURNIAN

  1. Abu total Tidak lebih dari 1%. Lakukan penetapan seperti tertera pada Abu <707>.

  2. Susut pengeringan <912> Tidak lebih dari 6%. Lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 2 jam.

  3. Sisa pelarut <716> Metode 1 Tidak lebih dari 200 bpj metanol dan tidak lebih dari 5000 bpj etanol.

  4. Arsen <708> Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik serapan atom hidrida yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  5. Timbal Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik spektroskopi serapan atom yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.

  6. Uji mikrobiologi <51> Angka lempeng total: tidak lebih dari 1.000 cfu per g; Kapang dan khamir: tidak lebih dari 200 cfu per g; Salmonella spp: negatif dalam 25 g; E.coli: negatif dalam 1 g.

PENETAPAN KADAR Total glikosida steviol dalam glikosida steviol dimodifikasi enzim yang di glukosilasi diukur sebagai persentase gabungan dari glikosida steviol dan glikosida steviol terglukosilasi pada zat kering bebas dekstrin. Pemisahan fraksi dekstrin dan glikosida steviol dilakukan dengan kolom adsorpsi dan elusi menggunakan air dan etanol. Kedua fraksi dikeringkan dan ditimbang untuk mendapatkan persentase relatif dekstrin dan glikosida steviol total (Tahap 1). Persentase steviol induk yang diglukosilasi dan tidak bereaksi ditentukan dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi dibawah ini (Tahap 2).

Tahap 1: Kolom Adsorpsi

Larutan uji Timbang saksama lebih kurang 4 g zat, masukan gelas ukur dan larutkan dalam 100 ml air. Catat bobot dan volum; kadar larutan uji lebih kurang 4%.

Prosedur Masukkan Larutan uji ke dalam kolom kaca (diameter dalam 25 mm) yang berisi 200 ml resin Sigma Amberlite XAD 7 HP, atau yang setara, dengan kecepatan lebih kecil 3 ml/menit. Elusi dengan 1000 ml air untuk menghilangkan dekstrin. Selanjutnya, elusi dengan 1000 mL etanol P 70% dengan kecepatan 3 ml/menit atau kurang untuk menghilangkan glikosida steviol. Uapkan kedua fraksi yang terelusi tersebut hingga kering, lalu keringkan dalam oven vakum pada suhu 105° selama 2 jam. Timbang dan catat berat kering masing-masing fraksi.

Hitung persentase dekstrin dan Total Glikosida Steviol (TGS):

Wdry-1 = bobot kering sampel awal (g)
LoD% = Susut Pengeringan (%)
Wwet-1 = bobot bawah sampel awal (g)
D% = dekstrin (%)
Wfw-dry = bobot fraksi air kering (g)
Wfe-dry = bobol fraksi air kering (g)

Jika kandungan residu dekstrin lebih dari 4%, TGS yang disesuaikan berdasarkan zat kering bebas dekstrin dihitung dengan rumus berikut:

TGSadj% = TGS yang disesuaikan (%)
Wdry-1 = bobot kering sampel awal (g)
WD = bobot dekstrin (g)

Tahap 2: Penetapan Kadar dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kesetimbangan Serbuk zat uji harus disetimbangkan tidak kurang 12 jam sebelum penetapan kadar. Taburkan 4-5 g zat uji dalam wadah terbuka hingga membentuk lapisan tipis setebal tidak lebih dari 6 mm. Aduk sesekali untuk memastikan keseragaman penyerapan kelembaban absorbsi yang seragam. Susut pengeringan zat uji yang disetimbangkan harus ditetapkan bersamaan dengan analisis KCKT.

Pengencer 50% etanol P dalam air.

Campuran larutan penanda Timbang masing-masing 100 mg rubusosida, dulkosida A, steviosida, rebaudiosida C, rebaudiosida F dan rebaudiosida A masukan dalam wadah dan tambahkan Pengencer hingga 1000 ml.

Larutan pembanding Rebaudioside A Timbang saksama lebih kurang 125 mg pembanding rebaudioside A, masukkan ke dalam labu tentukur 25-ml. Larutkan dan encerkan dengan Pengencer sampai tanda. Buat duplo. Kadar masing-masing larutan 5000 mg/l.

Larutan uji Timbang saksama lebih kurang 2500 mg zat, masukkan ke dalam labu tentukur 50-ml. Larutkan dan encerkan dengan Pengencer sampai tanda. Buat duplo. Kadar masing-masing larutan 50.000 mg/l.

Sistem kromatografi Kromatograf cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor UV dengan panjang gelombang 210 nm (4 nm bw); reference: 360 nm (100 nm bw), kolom 250 mm x 4,6 mm berisi Zorbax NH2 dengan ukuran partikel 5μm, laju alir lebih kurang 1 ml/menit, pertahankan kolom pada suhu 40°.

Kromatografi diprogram sebagai berikut:

Waktu (menit) Fase gerak A (%) Fase gerak B (%)
0 80 20
2 80 20
90 50 50
91 80 20
100 80 20

Analisis Total Parent Steviol Glycosides:

Prosedur Suntikkan secara terpisah sejumlah volume yang sama (lebih kurang 12 µl) Campuran larutan penanda dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam kromatogram dan ukur semua respons puncak. Hitung persentase setiap glikosida steviol pada masing–masing kromatogram dengan membandingkannya dengan Gambar 1.

Kesesuaian sistem Suntikkan Larutan pembanding Rebaudioside A pertama masing-masing 8,0; 10,0 dan 12,0 μl ke dalam kromatograf, catat kromatogram. Buat kurva baku luas area puncak terhadap kadar rebaudiosida A (mg/l) dari respon tiga titik Larutan pembanding Rebaudioside A tersebut.

Suntikkan 12 μl Larutan pembanding Rebaudioside A kedua, bandingkan respon area puncak dengan kurva baku, nilai perolehan kembali harus berada dalam rentang 98-102%.

Suntikkan masing–masing 12 μl Larutan uji pertama dan kedua, rekam kromatogram, ukur rerata respon puncak. Simpangan baku relatif (%) kandungan rebaudioside A dan stevioside pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 2,0%.

Hitung kadar glikosida steviol (GS) dalam Larutan uji menggunakan rumus:

A = luas puncak glikosida steviol
m = kemiringan kurva standar rebaudioside A
b = perpotongan y dari kurva standar rebaudioside A

[Catatan: Kalikan kadar glikosida steviol lain yang ada dengan faktor koreksi masing-masing untuk mengoreksi perbedaan bobot molekul. Faktor koreksi untuk rubusosida, dulkosida A, steviosida, rebaudiosida C, rebaudiosida F berturut-turut adalah 0,665; 0,815; 0,832; 0,983, dan 0,969 (dibandingkan dengan rebaudiosida A)]

Hitung persentase setiap glikosida steviol dalam Larutan uji menggunakan rumus:

GS = kadar glikosida steviol yang telah ditentukan di atas (mg/l)
CSampel = Kadar zat Larutan uji (mg/l)

Jumlahkan komponen glikosida steviol untuk menentukan Total Parent Steviol Glycosides (TPSG%).

Analisis α-glikosida steviol terglukosilasi:

Gunakan data TPSG% yang diperoleh dari uji KCKT dengan rumus berikut untuk menghitung kandungan total α-glikosida steviol terglukosilasi:

Total α-glikosida steviol terglukosilasi% = TGS% – TPSG%

Setiap komponen α-glikosida steviol terglukosilasi diidentifikasi dengan membandingkannya dengan Gambar 2.

A picture containing sketch, diagram, line, text Description automatically generated

Gambar 1. Kromatogram Campuran Larutan Pembanding

Chart, histogram Description automatically generated

Gambar 2. Kromatogram Larutan Uji Glikosida Steviol Dimodifikasi Enzim yang Terglukosilasi