Nisin

NISIN

Nisin
INS 234
CAS [1414-45-5];

DEFINISI Nisin merupakan senyawa polipeptida bersifat anti mikroba yang dihasilkan Lactococcus lactis subsp. lactis dengan kondisi fermentasi yang sesuai. Polipeptida utama hasil fermentasi adalah Nisin A. Nisin diproduksi dari media steril padat susu tanpa lemak atau non susu, seperti ekstrak ragi dan padatan karbohidrat. Proses fermentasi diatur untuk waktu dan pH, sampai produksi nisin optimum telah dicapai. Nisin ini kemudian dipekatkan, diambil dan dimurnikan dari medium fermentasi dengan berbagai metode, seperti injeksi steril, filtrasi membran, pengasaman, penggaraman, ultrafiltrasi atau pengeringan semprot. Nisin murni kemudian distandardisasikan dengan natrium klorida untuk mencapai tingkat aktivitas yang diinginkan. Nisin stabil pada suhu ruang dan ketika dipanaskan di bawah kondisi asam (sampai pH 3). Nisin secara komersial tersedia sebagai sediaan seperti mengandung 2,5% b/b nisin, >50% natrium klorida; bahan lainnya adalah susu padat dan produk hasil fermentasi meliputi protein dan karbohidrat. Aktivitas nisin ditentukan dalam Unit Internasional (UI). Satu UI nisin setara dengan 0,025 µg.

Abu = alpha-aminobutyric acid

Dha = dehydroalanine

Dhb = dehydrobutyrine

Nisin A

C₁₄₃H₂₃₀O₃₇N₄₂S₇	BM 3354,12

Nisin mengandung C₁₄₃H₂₃₀O₃₇N₄₂S₇ tidak kurang dari 900 IU per miligram (atau 22,5 µg/mg).

PEMERIAN Serbuk halus, putih sampai coklat muda

KELARUTAN Larut dalam air, tidak larut dalam pelarut non polar

PENGGUNAAN Pengawet Antibakteri

IDENTIFIKASI

Perbedaan dari anti mikroba lain Memenuhi syarat. Lakukan penetapan seperti tertera pada prosedur berikut:

Stabilitas terhadap asam

Larutan persediaan zat: suspensikan 1 g zat dalam 1 liter asam klorida 0,02 N sehingga larutan mengandung 1000 IU/ml.

Larutan zat: buat pengenceran Larutan persediaan zat dengan asam klorida 0,02 N sehingga memberikan konsentrasi 50 IU/ml. Didihkan larutan ini selama 5 menit dan ukur aktivitas nisin seperti pada Penetapan aktivitas nisin pada metode Penetapan kadar. Konsentrasi nisin pada zat yang didihkan harus 100% (+/-5%) dari nilai kadar mengindikasikan tidak ada penurunan kadar yang bermakna pada pemanasan.

Ketidakstabilan terhadap basa

Atur pH pada sisa larutan nisin yang didihkan dari uji Stabilitas terhadap asam sampai 11,0 menggunakan natrium hidroksida 5N. Panaskan larutan pada 65^o selama 30 menit, dan kemudian dinginkan. Atur pH sampai 2,0 dengan penambahan asam klorida tetes demi tetes. Ukur aktivitas nisin seperti tertera pada Penetapan aktivitas nisin pada Penetapan kadar. Hitung kehilangan aktivitas anti mikroba nisin dengan perlakuan ini. Kehilangan total aktivitas anti mikroba harus terlihat pada perlakuan yang dijelaskan berikut ini.

Toleransi Lactococcus lactis terhadap nisin konsentrasi tinggi

Siapkan kultur L. lactis (ATCC 11454, NCIMB 8586) pada skim steril (<1% lemak) susu dengan menginkubasi selama 18 jam pada 30 ^o. Siapkan satu atau lebih labu mengandung 100 ml susu lakmus, dan sterilkan pada 121^o selama 15 menit. Suspensikan 0,1 g zat dalam susu lakmus steril, dan biarkan pada suhu ruang selama 2 jam. Tambahkan 0,1 ml biakan L. lactis, dan inkubasi pada 30^o selama 24 jam. Catat pertumbuhan L. lactis. L. lactis akan tumbuh pada kadar zat (lebih kurang 1000 UI/ml); namun akan terhambat pertumbuhannya pada kadar yang serupa terhadap anti mikroba lain.

Aktivitas nisin Zat memperlihatkan aktivitas nisin. Lakukan penetapan seperti tertera pada Penetapan kadar.

KEMURNIAN

Susut pengeringan <912> Tidak lebih dari 3,0% Lakukan pengeringan pada suhu 105° selama 2 jam.
Natrium klorida Tidak kurang dari 50%. Lakukan penetapan dengan prosedur berikut ini:

Timbang saksama lebih kurang 200 mg zat, masukkan dalam labu bersumbat kaca yang mengandung 50 ml air. Kocok labu untuk melarutkan zat, sabil ditambahkan 3 ml asam nitrat P, 5 ml nitrobenzen P, 50,0 ml larutan perak nitrat 0,1 N baku dan 2 ml besi amonium sulfat LP. Kocok larutan agar homogen, dan titrasi kelebihan perak nitrat dengan larutan amonium tiosianat 0,1 N LV. Titik akhir titrasi ditandai dengan kemunculan warna merah. Hitung persentase kadar natrium klorida dalam zat dengan formula berikut:

A = konsentrasi larutan perak nitrat;

B = konsentrasi larutan ammonium tiosianat;

V = volume ammonium tiosianat (ml)

W = berat zat (mg)

Timbal Tidak lebih dari 1 bpj. Lakukan penetapan menggunakan teknik spektroskopi serapan atom yang sesuai seperti tertera pada Cemaran logam <702>.
Uji mikrobiologi <51> Salmonella spp: negatif per 25 g zat, Koliform: Tidak lebih dari 30 per g zat, E. coli: negatif per 25 g zat

PENETAPAN KADAR Penetapan kadar nisin dinyatakan dalam Unit Internasional (UI), menyatakan jumlah nisin yang dibutuhkan untuk menghambat satu sel bakteri dalam satu mililiter broth. 1 UI nisin setara dengan 0,025 µg. Sediaan komersial nisin secara spesifik terdiri dari nisin 2,5% b/b bersama dengan natrium klorida padatan lemak susu.

Penentuan aktivitas nisin

Pembuatan organisme uji Lactococcus lactis subsp. cremoris (ATCC 14365, NCDO 495) disubkultur setiap hari pada susu steril dengan memindahkan satu ose ke dalam botol McCartney susu lakmus dan diinkubasi pada suhu 30^o. Buat inokulasi susu untuk penetapan kadar dengan menginokulasikan sejumlah susu skim steril dengan 2% dari kultur 24 jam, dan tempatkan dalam tangas air pada 30° selama 90 menit. Gunakan segera.

Larutan persediaan baku Larutkan sejumlah nisin baku yang telah ditimbang saksama dalam 0,02 N asam hidroklorida sehingga diperoleh larutan dengan kadar 5000 UI per ml. Segera sebelum digunakan, encerkan larutan dengan asam hidroklorida 0,02 N agar diperoleh kadar 50 unit/ml.

[Catatan: Nisin mengandung 2,5% nisin b/b, pada potensi minimum 106 UI nisin per gram (UI/g).]

Larutan uji Timbang saksama zat dengan jumlah nisin uji mirip dengan seri larutan baku. Encerkan larutan dengan asam hidroklorida 0,02 N agar diperoleh kadar larutan mendekati 50 UI per ml.

Larutan Resazurin Buat larutan resazurin 0,0125% b/v dalam air, selalu dibuat baru sebelum digunakan.

Prosedur Pipet sejumlah larutan dengan volume bertingkat (0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,41; 0,38; 0,34; 0,31; 0,28; 0,26 ml) dari 50 UI/ml Larutan uji dan Larutan baku ke dalam dua baris berisi 10 tabung reaksi untuk bakteriologis dengan ukuran 6 x 5/8 inci. Tambahkan masing-masing 4,6 ml susu terinokulasi dengan pipet otomatis [Catatan Penambahan susu terinokulasi harus dilakukan secara bergantian, berseberangan tiap baris tabung yang mengandung kadar yang sama, bukan sepanjang tiap baris.] Tempatkan tabung reaksi dalam tangas air dengan suhu 30^o selama 15 menit, kemudian dinginkan dalam tangas es sambil ditambahkan 1 ml larutan resazurin. Tambahkan larutan resazurin dengan urutan yang sama seperti urutan penambahan susu terinokulasi, gunakan pemipet otomatis. Homogenkan campuran dengan pengocokan. Lanjutkan inkubasi di atas tangas air selama 3-5 menit.

Amati tabung reaksi baku dan zat di bawah lampu berfluorosensi dalam lemari khusus. Bandingkan tabung reaksi zat dengan konsentrasi tertinggi yang memperlihatkan perbedaan jernih pertama dalam warna (yaitu berubah dari biru ke ungu muda) dengan tabung baku untuk menentukan warna yang paling mendekati. Tentukan persamaan lebih lanjut pada dua konsentrasi lebih rendah berikutnya dari zat dengan baku. Interpolasikan kesusain yang dibuat pada pengenceran setengahnya. Tentukan dari tiga kali pembacaan larutan dan buat reratanya. Hitung aktivitas nisin dalam zat dari aktivitas nisin baku.

Konversi aktivitas nisin dari UI ke µg nisin menggunakan faktor konversi 1 UI = 0,025 µg