PEWARNA <1301>
Identifikasi dengan kromatografi
Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT) sangat berguna dalam identifikasi pewarna dan tidak memerlukan peralatan yang mahal. Namun perlu diingat bahwa nilai Rf dari suatu zat pada umumnya merupakan besaran yang tidak pasti karena beberapa faktor yang dapat berpengaruh pada nilai Rf. Faktor-faktor ini antara lain komposisi dan kesegaran campuran fase gerak, kejenuhan uap fase gerak dalam bejana kromatografi, mutu kertas kromatografi, arah pengembangan yang tertera pada kertas, jenis dan mutu pewarna ikutan, kadar, nilai pH larutan dan suhu. Untuk alasan ini, pengerjaan kromatografi harus menggunakan pewarna pembanding. Jika menggunakan suatu fase gerak, terjadi dua atau lebih pewarna menunjukkan Rf yang sama, lakukan kromatografi ulang dengan fase gerak yang berbeda.
Tabel berikut menyajikan perkiraan nilai Rf yang diperoleh jika larutan encer 1% berbagai pewarna dianalisis dengan KLT menggunakan fase diam silika gel G serta sepuluh jenis fase gerak yang dibuat segar seperti daftar di bawah ini.
Nomor fase gerak
-
Iso-Propanol:amonia (bobot jenis 0,880):air (7:2:1)
-
Iso-Butanol:etanol:air:amonia (bobot jenis 0,880) (10:20:10:1)
-
Larutan jenuh kalium nitrat
-
Fenol:air (4:1, b/v)
-
Asam hidroklorida (bobot jenis 1,18):air (23:77)
-
Trinatrium sitrat:amonia (bobot jenis 0,880):air (2 g:15 ml:85 ml)
-
Aseton:2-butanon:amonia (bobot jenis 0,880):air (60:140:1:60)
-
n-Butanol:etanol:piridin:air (2:1:1:2)
-
Iso-Propanol:amonia (bobot jenis 0,880) (4:1)
-
n-Butanol:asam asetat glasial:air (10:5:6)
Nilai Rf dari beberapa pewarna larut air
(Pewarna yang disajikan dalam tabel ini bukan hanya pewarna yang diizinkan untuk digunakan sebagai pewarna makanan)
Catatan: Nomer 1 sampai 10 menunjukkan fase gerak (lihat atas)
| MERAH | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ponceau 4R (Ponceau 4R) | 16255 | 124 |
0,66 (0,85) |
0,75 | 0,88 | 0,03 | 0,95 | 1,00 | 0,60 | 0,90 | 0,11 |
0,52 (0,00-0,57) |
| Karmoisin (carmoisin) | 14720 | 122 |
0,65 (0,77) |
0,81 | 0,00-0,42 | 0,16 |
0,00 (0,00-0,32) |
1,00 | 0,65 | 0,88 |
0,34 (0,46) |
0,63 (0,11-0,70) |
| Amaranth | 16185 | 123 |
0,62 (0,48; 0,76) |
0,75 (0,83) |
1,00 (0,00-1,00) |
0,04 (0,16) |
1,00 | 1,00 |
0,40 (0,64; 0,66) |
0,90 |
0,10 (0,41) |
0,39; 0,67 |
| Eritrosin (Erythrosine) | 45430 | 127 |
0,85 (0,68; 0,79) |
0,91 (0,86; 0,74; 0,81) |
0,00; 0,10 |
0,00-0,90 (0,41) |
0,00 | 0,00-0,95 |
0,64; 0,66 (0,58) |
0,89 |
0,66 (0,57; 0,43) |
1,00 |
| Red 2G | 18050 | -- | 0,68 | 0,80 | 0,37 | 0,12 | 0,00-0,71 | 1,00 | 0,64 | 0,90 | 0,36 | 0,68 |
| JINGGA | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Orange G | 16230 | -- |
0,71 (0,67; 0,88) |
0,80 (0,75) |
0,64 (1,00; 0,35) |
0,23; 0,15; 0,04 | 0,73 | 1,00 |
0,64 (0,62; 0,50; 0,67) |
0,91 |
0,36 (0,32; 0,17) |
0,69 (0,46; 0,82) |
| Orange RN | 15970 | -- |
0,83 (0,62) |
0,88 (0,78) |
0,00 (0,00-0,42) |
0,42 (0,13) |
0,13 (0,38) |
0,76 (1,00) |
0,68 (0,65) |
0,92 |
0,64 (0,29) |
0,82; 0,71 |
| Kuning FCF (Sunset Yellow FCF) | 15985 | 110 |
0,75 (0,68) |
0,82 (0,74) |
1,00 (0,00-1,00) |
0,17; 0,03 | 1,00 | 1,00 |
0,65 (0,48) |
0,90 |
0,34 (0,10; 0,22) |
0,67 (0,46) |
| KUNING | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Tartrazin (Tartrazine) | 19140 | 102 | 0,66 | 0,77 | 0,46-1,00 | 0,08 | 1,00 | 1,00 | 0,52 | 0,93 | 0,14 | 0,50 |
| Yellow 2G | 18965 | -- | 0,63 | 0,80 | 0,77 | 0,21 | 0,74 | 1,00 | 0,62 | 0,92 | 0,21 | 0,75 |
| Kuning kuinolin (Quinoline Yellow) | 47005 | 104 | 0,63 |
0,88 (0,82) |
0,00-1,00 |
0,65 (0,21) |
0,26-1,00; 0,00-0,38 |
0,95 (0,35) |
0,54 (0,68) |
0,88 | 0,00-0,31; 0,64 |
0,11-0,75 (0,83) |
| Fast Yellow AB | 13015 | -- | 0,83; 0,88 | 0,81 | 1,00 | 0,14 | 0,97 | 1,00 | 0,56 | 0,93 | 0,36 | 0,66 |
| HIJAU, BIRU DAN VIOLET | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Green S atau Acid Brilliant-Green BS atau Lissamine Green | 44090 | 142 |
0,44 (0,52;0,68; 0,74) |
0,61 (0,67; 0,75; 0,81; 0,84) |
0,49 (0,24) |
0,53 (0,05; 0,36; 1,00) |
0,29 (0,43) |
1,00 |
0,46 (0,56; 0,71) |
0,75 (0,89; 0,92) |
0,07 | 0,55 |
| Indigotin (Indigotine) | 73015 | 132 |
0,56 (0,70) |
0,50-0,76 (0,78) |
0,00 (0,05; 0,90; 1,00) |
0,09; 0,18 (0,52) |
0,92 | 0,94 |
0,66 (0,71; 0,73) |
0,89; 0,84 |
0,37 (0,00-0,34) |
0,00-0,63 |
| HIJAU, BIRU DAN VIOLET | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
|
Indanthrene Blue atau Solanthrene Blue RS atau Anthragen Blue |
69800 | -- | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
|
Biru berlian FCF (Brilliant Blue FCF) |
42090 | -- |
0,64 (0,73) |
0,78 | 0,05 |
0,45 (0,68) |
0,10 | 0,00-1,00 |
0,61 (0,68) |
0,88 |
0,30 (0,49; 0,00-0,23) |
0,53 (0,64) |
| Patent Blue V | 42051 | 131 | 0,34-0,60 | 0,68 | 0,05 | 0,55 | 0,15 | 0,95 |
0,69 (0,72) |
0,84 (0,92) |
0,00-0,10 | 0,59 |
| Violet 6B | 42640 | -- |
0,73 (0,67; 0,91) |
0,80 (0,72) |
0,00 (0,00-0,48) |
0,62 (0,51-1,00) |
0,00-0,37 | 0,00-1,00 | 0,67 |
0,89 (0,62) |
0,37; 0,45; 0,70; 0,76 |
0,64 (0,71) |
| Methyl Violet | 42535 | -- |
0,91 (0,80) |
0,56; 0,81; 0,90 |
0,00 (0,00-0,31) |
0,79-1,00 | 0,00-0,80 |
0,00 (0,00-0,53) |
0,00-0,68 (0,11; 0,28; 0,53; 1,00) |
0,11 (0,90) |
0,94; 0,87 (0,00-0,83) |
0,75; 0,79 (0,00-0,70) |
| COKLAT DAN HITAM | C.I. No. | INS No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Brown FK | -- | -- | 0,78; 0,71; 0,66 | 0,79; 0,86 |
1,00 (0,00-1,00) |
0,69; 0,27; 0,15; 0,00 | 0,00-0,77 | 1,00 |
0,59; 0,64; 0,53 (0,37) |
0,93 |
0,34 (0,26; 0,53) |
0,00-0,73 |
| Chocolate Brown FB | -- | -- | 0,00-0,69 | 0,00-0,75 | 0,00-0,82 |
0,00 (0,00-0,23) |
0,00-1,00 | 0,00-1,00 | 0,36; 0,51; 0,62 | 0,87 | 0,00-0,38 | 0,00-0,75 |
| Coklat HT (Brown HT) | 20285 | -- | 0,00-0,63 | 0,74 | 0,00-1,00 |
0,00 (0,00-0,16) |
0,00-1,00 | 0,00-1,00 | 0,34; 0,43; 0,62 | 0,88 | 0,00-0,32 | 0,00-0,73 |
| Black PN atau Brilliant-Black BN | 28440 | 151 |
0,66 (0,47) |
0,75 |
0,00 (0,00-1,00) |
0,00 | 1,00 | 1,00 |
0,38 (0,61) |
0,85 | 0,05 | 0,00-0,43 |
| Black 7984 | 27755 | 152 | 0,62 | 0,75 | 1,00 | 0,00 | 1,00 | 1,00 |
0,38 (0,61) |
0,85 | 0,09 | 0,00-0,45 |
Keterangan : Nomor CI Colour Index Number; ( ) nilai Rf bercak pewarna ikutan intensitas rendah; “0,xx-0,yy” : garis antara dua bercak; Tabel dikutip dari Pearson, D. (1973) J. Assoc. Public Anal., 11, 137-138. Reprinted from Environmental Carcinogens – Selected Methods of Analysis, Vol. 4 – Some Aromatic Amines and Azo Dyes in the General and Industrial Environment (IARC Publications No. 40), International Agency for Research on Cancer, Lyon, 1981
Pengamatan intensitas warna bercak dilakukan saat kromatogram masih lembab dan sekali lagi setelah kering. Pengamatan tersebut harus dilakukan pada cahaya ruangan dan di bawah sinar ultraviolet (UV), karena banyak pewarna menunjukkan perubahan warna spesifik. Sinar UV sering dapat digunakan untuk mengidentifikasi cemaran tidak berwarna. Jika dimungkinkan, gunakan dua pengemisi UV yang menghasilkan panjang gelombang yang berbeda; satu lampu harus mengemisikan lebih kurang 250 nm.
Untuk memastikan hasil harus dilakukan uji dengan asam, basa dan pereaksi yang cocok lainnya. Semua uji dapat dilakukan dengan pipet kapiler halus pada tiap titik warna.
Persyaratan berikut harus dipenuhi saat identifikasi warna dalam pewarna dengan membandingkan dengan pewarna pembanding: Jarak migrasi yang setara dalam beberapa fase gerak; intensitas warna yang setara pada pengamatan cahaya ruangan dan sinar ultraviolet; dan perubahan warna yang sama jika diberi perlakuan dengan pereaksi.
Identifikasi dengan spektrofotometri
Daerah spektrum tampak pada pengujian spektrofotometri biasanya dilakukan sebagai langkah pertama dalam upaya identifikasi pewarna yang tidak diketahui. Banyak pewarna menunjukkan pita serapan spesifik pada daerah tampak. Spektrum daerah UV juga dapat digunakan dan harus diukur bersama dengan spektrum tampak.
Pengujian menggunakan spektrofotometer UV-tampak, spektrum harus diukur menggunakan lebih dari satu pelarut, atau jika dalam pelarut tunggal, dalam kondisi yang bervariasi. Spektrum larutan dalam air harus diukur dalam suasana netral (didapar dengan amonium asetat), asam (asam hidroklorida 0,1 N), dan basa (natrium hidroksida 0,1 N).
Banyak pewarna dapat dikarakterisasi secara pasti dengan mengamati perubahan spektrum serapan yang disebabkan oleh perubahan pH atau pelarut.
Untuk identifikasi pewarna selain spektrofotometri UV-tampak dapat digunakan spektrofotometri inframerah. Sebagai contoh untuk membedakan Sunset Yellow dan Orange GGN. Spektrum serapan UV-tampak kedua pewarna tersebut sangat mirip, sedangkan spektrum inframerah keduanya cukup berbeda karena gugus asam sulfonat dari Sunset Yellow menyerap radiasi inframerah dengan kuat.
Penyiapan zat uji untuk pengukuran spektrum inframerah dapat dilakukan dengan beberapa cara; yang sering digunakan adalah:
-
larutan pewarna dalam pelarut yang sesuai;
-
suspensi pewarna dalam cairan yang sesuai;
-
kalium bromida P (sejumlah 1-3 mg pewarna, didispersikan dalam kalium bromida P dan pindahkan ke dalam pengempa yang sesuai dengan tekanan 700 - 1.400 kg/cm2, menjadi cakram tipis transparan).
Struktur kristal atau karakteristik fisika lain dari pewarna dapat mempengaruhi spektrum yang diperoleh. Pastikan bahwa pita serapan cemaran dapat diidentifikasi. Pewarna yang akan diuji harus bebas air atau pelarut lain yang menyerap radiasi inframerah. Penyiapan zat uji dari pewarna larut air dilakukan dengan melarutkan pewarna dalam air, tambahkan sedikit asam asetat P, uapkan hingga hampir kering, lanjutkan pengeringan pada suhu lebih kurang 100° untuk menghilangkan sisa air.
Cara identifikasi lain
Jika kromatografi dan spektrofotometri tidak memberikan identifikasi positif lakukan identifikasi dengan mereduksi atau menguraikan pewarna, kemudian mengidentifikasi produk hasil reaksi tersebut. Teknik ini khususnya dapat diterapkan untuk identifikasi senyawa azo. Senyawa amin hasil reduksi dapat diidentifikasi dengan teknik kromatografi dan spektrofotometri.
Banyak cara lain yang telah diterapkan untuk identifikasi zat pewarna. Sebagai contoh, banyak pigmen memiliki struktur kristal yang terdefinisi jelas dan dapat diidentifikasi dengan pola difraksi X-ray atau dengan kristalografi X-ray. Beberapa pewarna dapat diubah menjadi turunan kristalin dan diidentifikasi dengan cara yang sama.
KADAR TOTAL PEWARNA
Dua metode umum digunakan untuk penetapan kadar total pewarna: ‘Kadar Total Pewarna secara Spektrofotometri’ dan ‘Kadar Total Pewarna secara Titrimetri dengan Titanium(III) Klorida.’
Semua pewarna dalam zat uji yang menyerap dalam daerah yang sama dengan warna utama akan berpengaruh pada spektrum yang digunakan untuk menghitung hasil; pewarna ikutan dengan daerah serapan yang berbeda tidak akan terukur. Metode ini menggunakan absorptivitas pewarna pembanding untuk menghitung kadar total pewarna.
Pada metode titrimetri dengan titan klorida diasumsikan isomer dan pewarna ikutan memiliki ekivalensi yang sama dengan pewarna utama.
Kadar total pewarna dengan spektrofotometri
Prosedur 1 – Pewarna larut air
Timbang saksama lebih kurang 250 mg zat, masukkan ke dalam labu tentukur 1000-ml. Larutkan dan encerkan dengan air bebas karbondioksida P atau pelarut lain seperti yang tertera pada masing-masing monografi, sampai tanda, goyangkan labu hingga larut. Encerkan hingga kadar yang sesuai seperti tertera pada masing-masing monografi. Ukur serapan (A) pada panjang gelombang serapan maksimum, menggunakan air atau pelarut yang sesuai sebagai blangko. Hitung kadar total pewarna dalam zat yang digunakan dengan salah satu rumus berikut:
atau
| A | = | Serapan Larutan zat pada panjang gelombang maksimum |
| A1cm1% | = | Serapan spesifik dari pembanding yang tercantum pada masing-masing monografi |
| a | = | Absorptivitas pembanding dalam liter per (g.cm) |
| F | = | Faktor pengenceran |
Prosedur 2 – Kadar pewarna larut pelarut organik
Timbang saksama lebih kurang 80 mg zat, masukkan ke dalam labu tentukur 100-ml (V1). Tambahkan 20 ml kloroform P bebas asam, campur hingga larutan jernih. Encerkan dengan sikloheksan P sampai tanda, campur. Pipet 5,0 ml larutan (v1) masukkan ke dalam labu tentukur 100-ml lain (V2), tambahkan sikloheksan P sampai tanda. Pipet 5,0 ml larutan ini (v2) ke dalam labu tentukur 100-ml (V3), tambahkan sikloheksan P sampai tanda. Ukur serapan larutan V3 (A) pada panjang gelombang serapan maksimum, gunakan sikloheksan P sebagai blangko. Lakukan secara cepat, hindarkan dari paparan udara dan cahaya langsung. Hitung kadar total pewarna dalam zat menggunakan salah satu rumus berikut:
atau
| A | = | Serapan Larutan zat pada panjang gelombang maksimum |
| A1cm1% | = | Serapan spesifik dari pembanding yang tercantum pada masing-masing monografi |
| a | = | Absorptivitas pembanding dalam liter per (g.cm) |
| 10-3 | = | Faktor koreksi untuk ml per liter |
| W | = | Bobot zat yang ditimbang (mg) |
Prosedur 3 – Kadar zat warna dari lakes
Timbang saksama sejumlah lakes yang diperkirakan memberikan serapan setara dengan pewarna asal seperti pengujian tertera pada Prosedur 1, masukkan ke dalam gelas piala 250 ml yang berisi 50 ml larutan asam hidroklorida encer (10 ml asam hidroklorida P:40 ml air). Panaskan sambil diaduk untuk melarutkan lakes, dinginkan pada suhu ruang. Pindahkan ke dalam labu tentukur 1000-ml, encerkan dengan dapar fosfat pH 7 sampai tanda, campur. Lakukan penetapan seperti tertera pada Prosedur 1 dan pada masing-masing monografi, menggunakan dapar fosfat pH 7 sebagai blangko.
Kadar total pewarna secara titrimetri dengan titanium(III) klorida
Prosedur untuk pewarna
Pembuatan titanium(III) klorida 0,1 N Didihkan 800 ml air secara kuat dalam gelas piala selama 1 menit, tutup dengan kaca arloji, dinginkan hingga suhu ruang. Dalam lemari asam, tambahkan 90 ml asam hidroklorida P menggunakan gelas ukur, aduk dan tambahkan 100 ml larutan titanium(III) klorida P 20%, encerkan dengan air sampai 1000 ml, campur. [Catatan Hindari terbawanya endapan putih dari botol pereaksi titanium(III) klorida]. Pindahkan larutan ke dalam labu pencadang. Pasang buret dan hubungkan ke gas inert (nitrogen atau argon). Lewatkan gas inert melalui larutan selama 1-2 jam dengan kran samping terbuka untuk menjaga tekanan udara. Sambil menjaga aliran udara, dorong titran dari pencadang masuk ke dalam buret. Kosongkan buret, buang titran dan isi kembali. Lakukan proses ini dua kali lagi. Hentikan aliran gas, tutup kran dan simpan larutan selama lebih kurang 72 jam sebelum digunakan.
*Pengaduk dalam pelaksanaannya dapat diganti dengan pengaduk magnetik
Pembakuan titanium(III) klorida 0,1 N Masukkan titanium(III) klorida 0,1 N ke dalam buret yang sudah dibilas. Gunakan dalam waktu 1 jam. Timbang saksama lebih kurang 3,0 g besi(II) amonium sulfat P ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml, tambahkan 200 ml air. Tambahkan 25 ml asam sulfat 10 N. Pipet 20 ml larutan kalium dikromat 0,1 N LV ke dalam labu. Goyangkan dan campur. Tutup labu dengan sumbat karet yang dilengkapi dengan pipa gas inlet dan outlet, dan ujung buret, masukkan pengaduk magnetik. Alirkan perlahan-lahan gas inert (argon atau nitrogen ultra high purity) ke dalam labu titrasi. Atur laju pengadukan dari lambat hingga cepat tanpa percikan. Lanjutkan pengadukan selama 1 menit sebelum titrasi (agar besi(III) yang terbentuk ekivalen dengan kalium dikromat yang ditambahkan) dan selama titrasi.
Setelah penambahan 15-17 ml titanium(III) klorida 0,1 N LV tetes demi tetes dalam waktu 2 menit. Hentikan aliran titran dan kurangi aliran gas inert. Masukkan 10 ml indikator amonium tiosianat P 50% ke dalam labu. Warna larutan menjadi merah kecokelatan. Tambahkan titanium(III) klorida 0,1 N LV tetes demi tetes dengan jeda 2-3 detik, hingga terjadi perubahan warna yang jelas dari merah kecokelatan menjadi hijau muda. Titik akhir (sekitar 20-21 ml) tercapai ketika warna hijau muda bertahan sekitar 20 detik. Hentikan aliran gas inert dan perlahan hentikan pengadukan. Catat volume (V) titanium(III) klorida 0,1 N LV yang digunakan dengan ketelitian 0,05 ml. Lakukan triplo.
Lakukan penetapan blanko dengan prosedur di atas tanpa kalium dikromat 0,1 N, membutuhkan kurang dari 0,5 ml titanium(III) klorida 0,1 N LV.
Hitung normalitas larutan titanium(III) klorida 0,1 N LV yang digunakan pada tiap titrasi, dengan rumus:
| N | = | Normalitas larutan baku kalium dikromat |
| 20 | = | Volume larutan kalium dikromat yang ditambahkan (ml) |
| V | = | Volume titanium(III) klorida yang digunakan untuk titrasi larutan baku kalium dikromat (ml) |
| VB | = | Volume titanium(III) klorida yang digunakan untuk titrasi blangko (ml) |
Penetapan kadar total pewarna dalam zat uji
Timbang saksama sejumlah zat seperti yang tertera pada masing-masing monografi. Masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml. Tambahkan 10 g natrium sitrat P atau 15 g natrium hidrogen tartrat P seperti yang tertera pada monografi. Tambahkan beberapa batu didih dan 150 ml air. Bilas dinding labu, tutup dengan kaca arloji, goyang perlahan untuk melarutkan. Didihkan di atas lempeng pemanas dalam lemari asam. Didihkan kuat paling kurang 10 detik untuk menghilangkan oksigen terlarut. (Hindari penguraian zat uji dengan tidak mendidihkan lebih dari 2 menit.) Angkat labu dari lempeng pemanas. Setelah 2-4 menit, angkat kaca arloji. Tutup labu dengan sumbat karet yang dilengkapi dengan pipa gas inlet dan outlet, ujung buret, masukkan pengaduk magnetik (labu masih panas). Alirkan perlahan gas inert ke dalam labu. Jalankan pengaduk magnetik, atur laju pengadukan dari lambat hingga cepat tanpa percikan. Lanjutkan pengadukan selama 1 menit sebelum titrasi (agar besi(III) yang terbentuk ekivalen dengan kalium dikromat yang ditambahkan) dan selama titrasi. Kecuali dinyatakan lain dalam monografi, titik akhir tercapai jika larutan menjadi tidak berwarna.
Segera titrasi dengan titanium(III) klorida 0,1 N yang sudah dibakukan tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna, hentikan selama 15-20 detik. Tambahkan titanium(III) klorida 0,1 N LV tetes demi tetes dengan jeda 1-2 detik. Jika larutan hampir mencapai titik akhir, hentikan lagi selama 20 detik. Lanjutkan titrasi seperti di atas dengan jeda 5-10 detik, hingga titik akhir yang bertahan selama 20 detik. Hentikan aliran gas inert dan perlahan hentikan pengadukan. Catat volume (V) titanium(III) klorida 0,1 N LV yang digunakan dengan ketelitian 0,05 ml.
Hitung persentase total pewarna dalam zat uji dengan rumus:
| V | = | Volume titran yang digunakan (ml) |
| F | = | $$\frac{D}{(1,00\ ml\ \times \ 0,1\ mek/ml)}$$ |
| D | = | Bobot pewarna yang setara dengan 1,00 ml titanium(III) klorida 0,1 N dinyatakan dalam masing-masing monografi (mg) |
| N | = | Normalitas titran titanium(III) klorida (mek/ml) |
| WS | = | Bobot zat yang ditimbang (mg) |
Penetapan Total Pewarna Dalam Lakes
Masukkan 150 ml air ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml, dan larutkan dapar seperti tertera pada monografi masing-masing dye (pewarna asal). Timbang saksama sejumlah lake yang setara dengan 35-40 ml titanium(III) klorida 0,1 N, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer. Tambahkan beberapa butir batu didih. Bilas dinding labu dengan air, tutup dengan kaca arloji. Didihkan di atas lempeng pemanas dalam lemari asam. Didihkan kuat paling kurang 10 detik untuk menghilangkan oksigen terlarut. (Hindari penguraian zat uji dengan tidak mendidihkan lebih dari 2 menit.) Angkat labu dari lempeng pemanas. Titrasi dengan titanium(III) klorida 0,1 N LV seperti tertera pada Penetapan kadar total pewarna dalam zat uji.