AKTIVITAS ALFA AMILASE BAKTERIAL <1001>

Prosedur ini digunakan untuk penentuan aktivitas alfa amilase, yang dinyatakan sebagai bacterial amylase units (BAU), dari olahan enzim yang berasal dari Bacillus subtilis var., Bacillus licheniformis var., dan Bacillus stearothermophilus. Pengujian ini tidak berlaku terhadap olahan yang mengandung beta amilase. Penetapan didasarkan pada waktu yang dibutuhkan untuk memperoleh derajat standar hidrolisis dari larutan kanji pada suhu 30±1°. Derajat standar hidrolisis ditentukan berdasarkan perbandingan warna iodin pada hidrolisat dengan Larutan kanji pembanding.

Pereaksi dan larutan

Warna pembanding rujukan Gunakan cakram warna α-Amilase (Orbeco Analytical Systems, Catalog No. 620-S5 atau yang setara). Sebagai alternatif, siapkan larutan padanan dengan melarutkan 25,0 g kobalt(II) klorida P dan 3,84 g kalium dikromat P dalam 100 ml asam hidroklorida 0,01 N. Larutan ini stabil jika disimpan dalam botol atau tabung komparator tertutup.

Dapar pH 6,6, timbang 9,1 g kalium dihidrogen fosfat P, masukkan ke dalam labu tentukur 1000-ml, tambahkan air sampai tanda (Larutan A). Timbang 9,5 g natrium fosfat dibasa P, masukkan ke dalam labu tentukur 1000-ml, tambahkan air sampai tanda (Larutan B). Tambahkan 400 ml Larutan A ke dalam 600 ml Larutan B, campur, jika diperlukan atur pH hingga 6,6 dengan menambahkan Larutan A atau Larutan B sesuai keperluan.

Larutan iodin persediaan Timbang 5,5 g iodum P dan 11,0 g kalium iodida P masukkan ke dalam labu tentukur 250-ml, encerkan dengan air sampai tanda. Simpan dalam botol kaca, buat segar setiap 30 hari.

Larutan iodin encer Timbang 20 g kalium iodida P masukan ke dalam labu yang sesuai, tambahkan 300 ml air dan 2,0 ml Larutan iodin persediaan. Secara kuantitatif pindahkan larutan ke dalam labu tentukur 500-ml, encerkan dengan air sampai tanda, campur. Larutan dibuat segar setiap hari.

Kanji pembanding Gunakan kanji larut (Soluble starch). Kanji dari kemasan baru, sebelum digunakan lakukan pengujian secara paralel dengan kanji yang sudah diketahui derajat hidrolisisnya. Variasi kekuatan diastatik lebih dari ±3º menunjukkan kanji dalam kemasan tersebut tidak memenuhi syarat.

Larutan kanji pembanding Timbang saksama 10,0 g Kanji pembanding masukkan ke dalam labu yang sesuai, dispersikan dalam 100 ml air dingin, tuangkan larutan ini ke dalam 300 ml air mendidih. Didihkan dan aduk selama 1 sampai 2 menit, dinginkan sambil terus diaduk. Secara kuantitatif pindahkan campuran ke dalam labu tentukur 500-ml dengan bantuan air, tambahkan 10 ml Dapar pH 6,6, encerkan dengan air sampai tanda.

Larutan uji Buat larutan zat hingga 10 ml dari larutan tersebut memberikan hasil antara 15 dan 35 menit dengan kondisi seperti tertera pada Prosedur.

Prosedur Pipet 5 ml Larutan iodin encer masukkan ke dalam tabung uji 13 x 100-mm, panaskan pada suhu 30±0,1° dalam tangas air, gunakan 20 tabung untuk tiap kali pengujian.

Pipet 20 ml Larutan kanji pembanding ke dalam labu Erlenmeyer 50 ml kemudian sumbat labu, inkubasikan selama 20 menit dalam tangas air pada suhu 30°. Pada 0 menit, secara cepat, pipet 10 ml Larutan uji masukkan ke dalam campuran yang telah distabilkan, campur segera, sumbat labu, dan tempatkan pada tangas air. Setelah 10 menit, pindahkan 1,0 ml campuran reaksi dari labu Erlenmeyer 50 ml ke tabung uji yang berisi larutan iodin encer, kocok tabung, kemudian tuangkan isi tabung ke tabung komparator yang mempunyai dimensi tinggi 13 mm sesuai dengan alat komparator yang digunakan, dan segera bandingkan dengan Warna pembanding rujukan, dengan meletakkan tabung berisi air di belakang cakram warna.

[Catatan: Pastikan bahwa ujung pipet tidak menyentuh larutan iodin agar tidak terjadi kontaminasi oleh iodin ke dalam campuran hidrolisis yang akan mengganggu reaksi enzim dan akan mempengaruhi hasil penetapan.]

Dengan cara yang sama ulangi prosedur pemindahan dan pembandingan pada interval waktu yang tepat hingga diperoleh warna alfa-amilase. Jika diperoleh dua pembandingan dalam rentang waktu 30 detik yang menunjukkan salah satu warna lebih gelap dan warna lainnya lebih terang dari Warna pembanding rujukan, catat titik akhir pada kuartal menit terdekat. Kocok tabung komparator di antara dua pembacaan. Minimalkan perbedaan penilaian warna antar operator dengan menggunakan prisma dan dengan mempertahankan jarak 15-25 cm antara tabung dengan mata operator.

Perhitungan Satu bacterial amylase unit (BAU) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang akan mendekstrinasi kanji pada laju 1 mg per menit pada kondisi pengujian yang ditentukan. Hitung aktivitas alfa amilase pada zat, yang dinyatakan sebagai BAU dengan rumus:

40	=	Faktor (400/10) yang diperoleh dari 400 mg kanji (20 ml dari 2% larutan) dan 10 ml alikuot zat yang digunakan
F	=	Faktor pengenceran (total pengenceran/ bobot zat dalam g)
T	=	Waktu dekstrinasi (menit)